כיצד לזהות חיידקים?
לחיידקים חיוביים גרם יש דופן תאית עבה במיוחד (עשויה מפולימר הנקרא פפטידוגליקן) המחזיקה כתם צבע טוב יותר מקירות התא הדקים יותר של חיידקים שליליים.
ברוב המקרים, זיהוי חיידקים נעשה באמצעות תהליך של חיסול כדי לצמצם את הבחירות עד שתגיע לנכון. לעשות את זה נכון זה תהליך מורכב להפליא, בין השאר בגלל שיש כל כך הרבה סוגים - כמה מדענים מעריכים שמספר מיני החיידקים יכול להיות מעל מיליארד! אפילו עם כל כך הרבה לבחירה, הזיהוי חשוב במיוחד במסגרת קלינית ורפואית. כדי להקל על העניין, ישנם סטנדרטים לזיהוי שמקורם בשימוש בטכניקות צביעה לבחינת מראה החיידק והתבוננות בתגובות החיידק למצבים שונים.
שיטה 1 מתוך 4: זיהוי חיידקים עם צביעת גרם
- 1השתמש בכתמי גרם כדי לראות אם חיידקים הם חיוביים בגרם או גרם שלילי. צביעת גרם היא הליך המאפשר לחלק חיידקים לשני סוגים נפוצים: גרם חיובי, ושלם גרם. לחיידקים חיוביים גרם יש דופן תאית עבה במיוחד (עשויה מפולימר הנקרא פפטידוגליקן) המחזיקה כתם צבע טוב יותר מקירות התאים הדקים יותר של חיידקים שליליים.
- סוגים שונים של חיידקים חיוביים גרם כוללים סטפילוקוקוס, סטרפטוקוקוס, מיקרוקוקוס וליסטריה.
- גזעי חיידקים שליליים נפוצים כוללים Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter ו- Fusobacterium.
- 2השתמש באמצעי בטיחות. החיידקים והכימיקלים שבהם תטפל במהלך הליך כתמי גרם הם עלולים להיות מסוכנים. חבשו משקפי מגן, כפפות ניטריל חד פעמיות ומעיל מעבדה בזמן ביצוע הכתם. שים את הכפפות החד פעמיות שלך וכל חומרי פסולת מזוהמים אחרים בשקית מסוכנת לאחר שתסיים. עקוב אחר נהלי המעבדה שלך לסילוק השקית המסוכנת.
- 3הפוך שקופית של דגימת החיידק שלך. כדי להתחיל בתהליך, הניח טיפה או חתיכה קטנה מדגימת החיידק שלך על שקף סטרילי. העבר את השקופית דרך הלהבה של מבער בונסן 3 פעמים כדי לתקן את הדגימה בחום. זה ימנע מהדגימה לשטוף כשמוסיפים ריאגנטים או שוטפים את השקופית.
- 4הוסף 5 טיפות סגול קריסטל לשקופית. מניחים את טיפות צבע הסגול הקריסטלי על התרבות קבוע החום. תן לדגימה לטבול בצבע סגול קריסטל למשך דקה אחת.
- כדי למנוע מכתים את היד שלך, ייתכן שתרצה להחזיק את השקף במקום בעזרת סיכת בגדים.
- 5שטפו את השקף בעדינות כדי להסיר את הכתם. השתמש בזרם מים עדין מאוד מכיור או בקבוק שפריץ. אין לשטוף יותר מחמש שניות. תהליך זה יסיר כל צבע שאינו קשור לדגימה.
- 6הוסף 5 טיפות של יוד של גרם לשקופית. יוד הגראם הוא תמיסה של יוד, אשלגן יוד, ונתרן ביקרבונט. פתרון זה יביא לצבע סגול הקריסטל להתמזג בדפנות התא של החיידק. הוסף כ -5 טיפות, והניח לו לשבת במשך דקה אחת.
- 7שוטפים את הדגימה עם אלכוהול או אצטון. אלכוהול ואצטון הם חומרי צבע. אם החיידקים שלך הם זן שלילי של גרם, חומרים אלה יסירו את הכתם מדפנות תאי החיידק. אפשר לכמה טיפות של חומר הצביעה לטפטף מעל הדגימה, ולתת לה לשבת לא יותר משלוש שניות. יש לשטוף בעדינות במים לא יותר מ -5 שניות כדי להסיר את האלכוהול או האצטון.
- אם תיתן לחומר הצביעה להישאר זמן רב מדי על הדגימה, הוא עלול להפשיט את הכתם מחיידקים חיוביים של גרם, ולגרום לתוצאה שלילית של גרם.
- 8מכתים נגד הפיתרון בספרנין. ספרנין הוא צבע אדום, שישמש ככתם נגד לסגול הקריסטל ויצבע כל חיידק שלא החזיק את הכתם הסגול. הוסיפו לדוגמא כ -5 טיפות תמיסת ספרנין, ותנו לה לשבת דקה אחת. שטפו בעדינות רבה במים למשך 5 שניות.
- 9צפה במדגם שלך במיקרוסקופ בהגדלה של פי 1000. אם החיידקים הם זן חיובי של גרם, הם יופיעו סגולים או סגולים מתחת למיקרוסקופ. חיידקים שליליים בגראם יופיעו אדומים מהכתם הנגדי בספרנין.
שיטה 2 מתוך 4: שימוש בטכניקת הכתם ziehl-neelsen
- 1השתמש בצביעת ziehl-neelsen כדי לאתר חיידקים מהירים בחומצה. חיידקים מהירים בחומצה מכילים כמות גבוהה יותר של שומנים בהשוואה לסוגים אחרים של חיידקים, מה שהופך אותם לעמידים בפני חומרי הצבע המשמשים לצביעת גרם. חיידקים מהירים בחומצה שייכים לסוג Mycobacterium, הכולל את החיידק הגורם לשחפת (M. tuberculosis). ניתן להכתים חיידקים מהירים בחומצה בצבע קרבול-פוקסין אדום, שיתנגד לשטיפה עם אלכוהול חומצי או תמיסת חומצה גופרתית.
- 2נקוט אמצעי בטיחות מתאימים. הכימיקלים והחומרים הביולוגיים המשמשים במהלך הליך צביעה של Ziehl-Neelsen עלולים להיות מסוכנים. תוכלו גם להשתמש במקורות חום, כמו מבער בונסן, מנורת רוח או תנור שקופיות חשמלי. נקוט באמצעי הזהירות הבאים בעת ביצוע הליך זה:
- חבוש משקפי מגן, כפפות ניטריל ומעיל מעבדה.
- הקפידו לא לשאוף אדים מפתרונות הצביעה והצביעה, או להעלות אותם על עורכם או בעיניכם. שמור את כל המכלים הפתוחים מתחת למכסה המנוע.
- היזהר מאוד בעת חימום השקופית שלך, מכיוון שרבים מהכימיקלים בהם תשתמש הם דליקים. יתכנו גם עקבות של כימיקלים דליקים על מדפי השקופיות וציוד אחר.
- 3הכן שקף. מורחים מריחה של הדגימה באופן שווה על מרכז השקופית הסטרילית, תוך שימוש בתנועות מעגליות. המריחה שלך צריכה להיות כ -10 מ"מ (1 ס"מ) על 20 מ"מ (2 ס"מ).
- 4ייבש את השקופית שלך. הניחו את השקף על מתלה ייבוש כשהמשטח כלפי מעלה. אפשר לו להתייבש באוויר למשך 30 דקות. אל תנסה למחוק את השקופית יבשה.
- 5חום תקן את המריחה שלך. ניתן לתקן את הדגימה בחום על ידי העברת השקופית מעל להבתו של מבער בונסן 2-3 פעמים, כשמריחה כלפי מעלה. לחלופין, הנח את השקף על שקופית חשמלית מחממת ב 65° -75°C (149° -75°C) למשך שעתיים לפחות. הקפידו לא לחרוך או להרתיח את הדגימה.
- 6הוסף כתם קרבול-פוקסין לשקופית שלך. שים כמה טיפות של תמיסת קרבול-פוקסין בשקופית. מוסיפים מספיק כדי לכסות את המריחה לחלוטין.
- 7מחממים את השקופית המוכתמת כדי לתקן את הכתם למריחה. מחממים את השקף בעדינות מעל מבער או מנורת רוח, מורחים את הצד כלפי מעלה, או מניחים אותו על תנור שקופיות חשמלי. מחממים את השקופית עד שהיא מגיעה ל- 60 מעלות צלזיוס (60 מעלות צלזיוס). אתה אמור לראות אדי מתחיל לעלות. תן לכתם המחומם לשבת על השקופית במשך 5 דקות.
- אם אתה משתמש במחמם שקופיות חשמלי, הגדר אותו ל- 60°C. אם אתה משתמש במבער או מנורת רוח, תצטרך להקפיד על הופעת אדים או אדים.
- כדי להחזיק את השקף בטמפרטורה הרצויה למשך 5 דקות תמימות, יש למרוח לסירוגין.
- הקפד לא להרתיח, לחרוך או לייבש לחלוטין את המריחה המוכתמת שלך.
- 8שוטפים את השקף במים קרים. תנו למגלשה להתקרר במשך כ -5 דקות, ואז שטפו בעדינות רבה כמה שניות במים נקיים מברז או מבקבוק לסחוט כדי להסיר כל כתם שאינו מודבק לדגימה.
- 9מכסים את המריחה באלכוהול חומצי או בחומצה גופרתית. הוסף מספיק 3% נפח על נפח (v / v) אלכוהול חומצי או 20% חומצה גופרתית כדי לכסות לחלוטין את המריחה. השאירו את החומצה על השקף עד שהכתם דעך לורוד בהיר מאוד. זה בדרך כלל לוקח לפחות 10 דקות.
- 10שטפו את השקף במים נקיים. שטפו בעדינות במים מברז או מבקבוק סחיטה, וודאו לשטוף את כל החומצה וכל שרידי הצבע שנותרו.
- 11הוסף כתם נגד לשקופית. לאחר שטיפת השקופית, יש לכסות את הכתם בירוק מלכיט או בתמיסה הכחולה של מתפלן של לופלר. פתרונות אלו יוצרים "רקע" ירוק או כחול המסייע לחיידקים הצבועים באדום, ויכתימו גם כל חומר ביולוגי אחר במגלשה (כמו תאים אנושיים וחיידקים שאינם חומצי). תן לכתם לעמוד 1-2 דקות.
- 12שוטפים ומייבשים את השקף. שטפו את השקף בעדינות במים נקיים כדי להסיר כתמי נגד עודפים. כשסיימתם, נגבו את החלק האחורי של השקף במטלית נקייה והניחו את השקף על מתלה לייבוש באוויר.
- 13בחן את השקופית תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 1000x. חיידקים מהירים בחומצה צריכים להיראות אדומים או ורודים חמים. חיידקים שאינם חומצה מהירים, תאים שאינם בקטריאליים והרקע יופיע כחול או ירוק.
צביעת גרם היא הליך המאפשר לחלק חיידקים לשני סוגים נפוצים: גרם חיובי, ושלם גרם.
שיטה 3 מתוך 4: התבוננות במראה החיצוני והתנהגותו
- 1התבונן בצורת החיידקים. ברגע שהשתמשת בכתים כדי לקבוע אם החיידקים שלך הם חיוביים גרם, גרם שלילי או מהיר בחומצה, הגיע הזמן לצמצם את סוג החיידקים. הצעד הראשון הוא לבחון את צורתם של החיידקים במגלשה. 3 הצורות הנפוצות ביותר הן קוקוס (כדורית), בצילוס (בצורת מוט) וספירלה.
- ישנן וריאציות רבות על כל הצורות הללו. לדוגמא, חיידקי קוקוס עשויים להופיע בתצורות שונות, כמו זוגות התמזגו (דיפלוקוקוס), שרשראות, אשכולות או קבוצות של 4 (טטרדות).
- 2קבע אם החיידקים אירוביים או אנאירוביים. קח 2 דגימות של החיידקים וצור 2 תרבויות נפרדות. תרבות אחת צריכה להיות אנאירובית (גדלה ללא חמצן) והשנייה צריכה להיות אירובית (גדלה עם חמצן). אחסן את התרבות האנאירובית שלך בסביבה נטולת חמצן בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס (35 מעלות צלזיוס) למשך 48 שעות לפחות לפני שתנסה לצפות בצמיחת חיידקים.
- אם החיידקים שלך גדלים בסביבה נטולת חמצן, אך לא כאשר הם נחשפים לחמצן, הם אנאירוביים.
- חיידקים הגדלים כאשר הם נחשפים לחמצן, אך לא כאשר הם מוחזקים בסביבה נטולת חמצן, הם אירוביים.
- חיידקים שיכולים לצמוח בשתי הסביבות נקראים אנאירובים פקולטטיביים.
- 3ערכו בדיקת תנועתיות כדי לברר אם החיידקים שלכם נעים. חיידקים ניוד יכולים לנוע בכוחות עצמם באמצעות דגל אחד או יותר כדי להניע את עצמם. תנועתיות, או חוסר תנועתיות, יכולים להיות גורם חשוב בזיהוי זן של חיידקים. ישנם מספר סוגים של מבחני תנועתיות, אך מבחן המדיום המוצק למחצה הוא הבטוח והקל ביותר לקריאה.
- 4צור תרבות למבחן התנועתיות שלך. הכן תרבית של חיידקים במרק מזין. הכינו את המרק לפי ההוראות למדיום המרק המועדף עליכם.
- 5חסן צינור של אגר תנועתיות חצי מוצק עם התרבות שלך. מצפים מחט חיסון סטרילית בחלק מתרבית המרק. דוקרים את המחט בזהירות ישר לצינור של אגר חצי מוצק שנוסח לבדיקת תנועתיות (כגון אגר TTC). המחט צריכה לעבור בערך 0,67 מהדרך לאגר.
- כשתסיים, משוך בזהירות את המחט, והקפד לא לשבור את "קו הדקירה" המקורי.
- דגירה של הצינור ב 30 מעלות צלזיוס (30 מעלות צלזיוס) למשך 48 שעות.
- 6קרא את תוצאות בדיקת התנועתיות. אגר תנועתיות הופך לאדום כאשר הוא בא במגע עם חיידקים. אם החיידקים שלך נעים, צבע אדום או ורוד יפוזר לאורך האגר. אם הם אינם תנועיים, תראה רק את הצבע האדום לאורך קו הדקירה המקורי.
שיטה 4 מתוך 4: הרכבת הכל
- 1חבר את התצפיות שלך יחד. כדי לצמצם את סוג החיידקים, יהיה עליכם לשלב את המידע מהכתמים, התרבויות והתצפיות שלכם על צורת החיידקים. אם אתה בוחן תרבות ממטופל, מידע על הסימפטומים שלהם יכול להיות שימושי גם לצמצום התחום.
- לדוגמא, אם הבדיקות שלך מגלות שהחיידקים שלך הם שלילי גראם, אנאירובי, ולא תנועתי, והם קשורים לכאבי בטן, בחילות והקאות אצל המטופל, הם עשויים להיות Bacteroides fragilis.
- 2התייעץ עם מאגר חיידקים. מכיוון שיש כל כך הרבה מינים של חיידקים, אי אפשר לזכור או להכיר את כולם לבד. כנראה שתצטרך להתייעץ עם ספר לימוד למיקרוביולוגיה קלינית או מסד נתונים מקוון ולחפש חיידקים עם כל מאפייני המדגם שלך.
- משאבים מקוונים טובים לזיהוי חיידקים כוללים את מרכז שילוב המשאבים של Pathosystems (patricbrc.org) ואת מאגר החיידקים הפתוגניים ב- GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
- 3השתמש בבדיקות גנטיות כדי לקבוע את המינים המדויקים של חיידקים. במקרים מסוימים יתכן שיהיה צורך לזהות את המינים המדויקים של החיידקים. הדרך המהירה והיעילה ביותר לעשות זאת היא באמצעות בדיקת DNA. בדיקות DNA מועילות גם לזיהוי חיידקים המתנגדים לצורות מסורתיות של גידול או מכתים. ניתן לבצע בדיקות DNA חיידקיות מודרניות במהירות רבה, לפעמים תוך פחות משעתיים.
- אם אין לך גישה למעבדה שעושה רצף של גנום מיקרוביאלי, שלח דגימה למתקן מומחה, כגון מעבדות MIDI או CD Genomics.
חיידקים מהירים בחומצה מכילים כמות גבוהה יותר של שומנים בהשוואה לסוגים אחרים של חיידקים, מה שהופך אותם לעמידים בפני חומרי הצבע המשמשים לצביעת גרם.
- השתמש תמיד באמצעי בטיחות בעבודה עם דגימות מיקרוביאליות וריאגנטים למכתים. אם אתה מרגיש חולה לאחר עבודה עם דגימות של חיידקים, פנה מיד לטיפול רפואי.
- נהלים אלה צריכים להיעשות תמיד במעבדת מיקרוביולוגיה עם ציוד תקין.
זיהוי חיידקים עם צביעת גרם
- דגימות חיידקים
- משקפי מגן
- כפפות ניטריל
- חלוק מעבדה
- שקופיות מיקרוסקופ
- מתלה ייבוש שקופיות
- מבער בונזן
- מנורת רוח או תנור שקופיות חשמלי
- סיכת בגדים
- בקבוק מים
- תמיסת סגול קריסטל גראם
- תמיסת יוד גרם
- תמיסת אתנול או אצטון
- פתרון גרם ספרנין
- מיקרוסקופ המסוגל להגדיל 1000X
ברגע שהשתמשת בכתים כדי לקבוע אם החיידקים שלך הם חיוביים גרם, גרם שלילי או מהיר בחומצה, הגיע הזמן לצמצם את סוג החיידקים.
שימוש בטכניקת הכתם של זיהל-נילסן
- דגימות חיידקים
- משקפי מגן
- כפפות ניטריל
- חלוק מעבדה
- שקופיות מיקרוסקופ
- מתלה ייבוש שקופיות
- מבער בונזן
- מנורת רוח או תנור שקופיות חשמלי
- בקבוק מים
- מכסה מנוע
- פתרון קרבול-פוקסין
- 20% חומצה גופרתית או אלכוהול חומצה 3% v / v
- ירוק מלאכיט או תמיסת מתילן כחולה של לופלר
- מיקרוסקופ המסוגל להגדיל 1000X
התבוננות במראה ובהתנהגות של חיידקים
- מיקרוסקופ המסוגל להגדיל 1000X
- תרבויות חיידקים אירוביות ואנאירוביות
- מרק מזין בינוני
- אגר תנועתיות חצי מוצק
- מחט חיסון
שאלות ותשובות
- האם ניתוח דם בשטח יכול לראות חיידקי סטרפטוקוקוס?כן, זה יכול בגלל שהם חיוביים גרם והם עשויים להכתים את הסגול הבינוני. לאחר מכן ניתן לתאם זאת עם מצגות קליניות.
שאלות ללא מענה
- מהם 5 מאפיינים הדרושים לזיהוי זנים טהורים של חיידקים?
- באיזו טכניקה מולקולרית הייתי משתמש אם הייתי רוצה לדעת איזה מיני מיקרואורגניזם אני מבודד?
